ДНК-диагностика: ПЦР-анализ.

     ДНК-диагностика – это один из наиболее современных высокотехнологичных методов исследования, который широко применяется в диагностике инфекционных заболеваний, позволяя обнаруживать даже единичные микроорганизмы в организме человека. В современной клинической практике ДНК-диагностика объединяет несколько методов исследования, самым распространенным из которых является метод ПЦР (полимеразной цепной реакции).

     Первоначально сам принцип метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) был разработан Кэрри Мюллисом в 1983 г. Открытие полимеразной цепной реакции стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии в последней четверти XX века, и за разработку ПЦР-анализа Кэрри Мюллис уже в 1993 г. был удостоен Нобелевской премии в области химии.

     Анализ методом ПЦР основан на обнаружении в материале исследования небольшого фрагмента ДНК возбудителя той инфекции, которую подозревает врач. Говоря «небольшой фрагмент ДНК», мы подразумеваем «обрывок» нуклеиновой цепочки длиной всего в несколько сотен пар нуклеотидов – тогда как любая, самая простая ДНК включает в себя не менее нескольких тысяч оснований. Такой подход является наиболее эффективным при диагностике внутриклеточных паразитов и медленнорастущих микроорганизмов, требующих сложных условий культивирования для ранее использовавшихся способов диагностики.

     Благодаря высокой точности определения появилась возможность поиска возбудителей болезней практически в любом биологическом материале. Сегодня методу ПЦР-анализа подвергаются:

     • соскоб эпителиальных клеток (соскоб из уретры у мужчин и у женщин, соскоб из цервикального канала);

     • кровь, плазма, сыворотка крови;

     • биологические жидкости (сок простаты, плевральная, спинномозговая, околоплодная, суставная жидкости, слюна);

     • моча;

     • мокрота;

     • биопаты желудка и двенадцатиперстной кишки;

     • слизь и другие биологические выделения.

      

Достоинства метода

      

     • Высокая специфичность за счет того, что искомые кусочки генетического материала имеют уникальные последовательности ДНК.

     • Высокая чувствительность за счет многократного размножения исходного материала.

     • Универсальность – при правильном подходе может быть проанализирован любой материал.

     • Быстрое получение результата (в отличие от бактериологических методов, где результата приходится ждать довольно долго).

     • Возможность одновременной диагностики многих возбудителей (анаэробов и аэробов; вирусов, бактерий и грибов).

     • Для некоторых микроорганизмов ПЦР является практически единственным методом диагностики (например, для Mycoplasma genitalium).

     ПЦР-анализ может быть качественный и количественный – т. е. может просто свидетельствовать о наличии того или иного возбудителя, а может и давать информацию о количественном содержании возбудителя в тех или иных биологических материалах.

      

Как подготовиться к ПЦР-анализу

      

     Достоверность результатов лабораторной диагностики ПЦР зависит не только от опыта и профессионализма врача-лаборанта, возможностей данной лаборатории, но и от того, соблюдал ли пациент рекомендации врача, насколько правильной была его подготовка к проведению анализа. При сдаче анализа методом ПЦР врачи рекомендуют соблюдать следующие правила:

     • за сутки до проведения анализа не жить половой жизнью;

     • сдача ПЦР-анализа крови проводится натощак, т. е. необходимо ничего не есть, не пить и не жевать жвачку;

     • для ПЦР-анализа мочи используется первая утренняя порция, собранная в стерильный контейнер.

      

ПЦР-анализы

      

     В устоявшейся клинической практике ПЦР-анализы обычно сдают «блоками[16]» на определенные группы возбудителей.

     Например:

     • ПЦР-диагностика инфекций, передаваемых половым путем, где одновременно выявляются:

     – бактериальные инфекции: Chlamydia trachomatis (хламидия), Mycoplasma hominis (микоплазма человека), Gardnerella vaginalis (гарднерелла), Mycoplasma genitalium (микоплазма генитальная), Ureaplasma parvum (уреаплазма парвум), Ureaplasma urealyticum (уреаплазма уреалитикум), Neisseria gonorrhoeae (гонококки);

     – вирусные инфекции: HPV (Human Papillomavirus, папилломавирус человека) типы 16, 31, 33, 35Н, 52, 58, 67; типы 18, 45, 39, 59; тип 6, 11; тип 26, 51;

     – инфекции, вызванные простейшими: Trichomonas vaginalis – трихомонады;

     – грибковые инфекции: Candida albicans – кандида;

     • ПЦР-диагностика бактериальных инфекций:

     – бруцеллы : Brucella species вызывает заболевания дыхательных путей, мочевыделительной системы, органов половой сферы и опорно-двигательного аппарата;

     – гемофилы: к настоящему времени известно 9 видов гемофил, вызывающих инфекции у человека. Haemophilus ducrei вызывает инфекции, передающиеся половым путем (симптомы – обильные водянистые, периодически гноевидные выделения с неприятным запахом из половых путей, дизурические явления). Haemophilus speciec вызывает заболевания дыхательных путей (симптомы – поражение дыхательных путей; кашель с мокротой; повышение температуры тела; слабость, недомогание);

     – кампилобактерии: Сampulobacter species вызывает воспалительные заболевания половых органов у женщин и мужчин со следующими симптомами:

     – дизурические явления (небольшие рези при мочеиспускании);

     – слизисто-гнойные выделения из половых путей;

     – тянущие боли внизу живота;

     – листерии: Listeria monocytogenes вызывает заболевания отделов малого таза, мочевыводящих путей, суставов, органов дыхания со следующими симптомами:

     – слизисто-гнойные выделения из половых путей;

     – боли внизу живота;

     – отек суставов, боли в суставах;

     – кашель с мокротой;

     – дизурические явления;

     – микобактерии туберкулеза: развитие туберкулезной инфекции вызывают 4 вида микобактерий: Mycobacterium tuberculosis; Mycobacterium bovis; Mycobacterium africanum; Mycobacterium microti. Однако в патогенезе туберкулеза у человека ведущая роль принадлежит именно Mycobacterium tuberculosis. Во всем мире каждый год регистрируют около 8 миллионов новых случаев этого тяжелого заболевания, около 3 миллионов человек ежегодно умирает от туберкулеза;

     – микоплазмы: внутриклеточные микробы, очень широко распространены в природе. Уреаплазмы – это особая и наиболее «популярная» разновидность патогенных для человека микоплазм. На их долю приходится большая часть хронических микоплазмозов человека. Кроме уреаплазм известно еще несколько видов безусловно патогенных для человека видов: Mycoplasma species, Mycoplasma pneumonia, Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium, Ureaplasma urealyticum, Urea-plasma parvum. Наиболее часто патогенными видами микоплазм поражаются:

     – мочеполовые органы: пиелонефрит, уретрит, нарушение овуляции и сперматогенеза;

     – сердечно-сосудистая система: артериальная гипотензия (гипотония), кардит, перикардит;

     – органы пищеварения: невирусный гепатит, гастрит, холецистит, кишечные дисфункции (упорные диареи);

     – респираторные органы: ОРЗ, хронический ринит, атипичная пневмония (не путать с азиатской «атипической пневмонией»!);

     – суставы: ревматоидный артрит, подагра;

     – центральная и периферическая нервная система: неврастении, невралгии, локальные болевые синдромы и, по некоторым данным, демиелинизирующие заболевания;

     – кожа и слизистые оболочки: повышенная ломкость и проницаемость капилляров, вульгарные угри, простой герпес (микоплазмы принимают участие в транспорте вируса);

     – нейссерии: для человека патогенными являются Neisseria gonorrhoeae и Neisseria meningitides, также у человека выделяют непатогенные виды N. sicca, N. mucosa, N. perflava. Neisseria gonorrhoeae является возбудителем специфического венерического заболевания – гонореи;

     – стрептококки: большинство стрептококков входят в состав нормальной микрофлоры дыхательных, мочевых, половых путей и ЖКТ, но некоторые их виды имеют важное значение как возбудители болезней человека:

     – стрептококки группы A (Streptococcus pyogenes) вызывают ангину – одну из самых распространенных среди детей школьного возраста инфекций, а также широко известные постинфекционные заболевания – ревматизм и острый гломерулонефрит;

     – стрептококки группы В (Streptococcus agalactiae) – основные возбудители сепсиса и менингита у новорожденных, послеродового сепсиса и эндометрита;

     – трепонема: Treponema pallidum – возбудитель сифилиса;

     – хеликобактер пилори: установлена четкая связь Helicobacter pylori с развитием гастрита, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, рака желудка и многих других заболеваний.

     • ПЦР-диагностика вирусных гепатитов, герпеса и других вирусных инфекций:

     – вирус Эпштейн-Барр (из семейства герпесвирусов) вызывает легкое заболевание у детей и инфекционный мононуклеоз у неиммунизированных подростков и взрослых, является вездесущей вирусной инфекцией и присутствует практически у 100 % популяции людей. Чаще всего заражение им происходит в раннем детском и в юношеском возрасте, поэтому более 90 % взрослых уже перенесли эту инфекцию в той или иной форме и имеют антитела к вирусу Эпштейн-Барр;

     – герпес: самая распространенная вирусная инфекция. Около 90 % людей на земле инфицированы герпесом. Только у 5 % инфицированных проявляются симптомы болезни, у остальных она протекает без клинических проявлений. Наиболее часто вирус поражает: глаза (конъюнктивит, кератит), слизистую губ, слизистые оболочки половых органов, центральную нервную систему (энцефалит, менингит). У беременных женщин вирус может вызвать патологию беременности, самопроизвольные аборты, преждевременные роды;

     – вирусные гепатиты – это гепатиты, вызванные вирусной инфекцией: А, В, С, G;

     – цитомегаловирус: это целая группа вирусов, которые могут присутствовать в любой жидкости организма человека (кровь, моча, слюна, сперма, секрет влагалища, грудное молоко и т. д.). Цитомегаловирус во многом схож с вирусом простого герпеса, поэтому его относят к разновидности герпетических инфекций. Цитомегаловирус как болезнь может развиться в результате ослабления защитных реакций организма: на фоне сильных стрессов, гриппа, обострения хронических заболеваний, осложнений беременности;

     – другие вирусные инфекции: ВИЧ, вирус Варицелла-Зостер, энтеровирус;

     • ПЦР-диагностика острых кишечных и респираторных инфекций:

     – респираторные инфекции: аденовирусы, грипп А и В, на РНК вируса гриппа A, A/ H1N1/CA/2009 (анализ на свиной грипп);

     – вирусные кишечные инфекции: астровирус, норовирусы 1-го и 2-го типов, ротавирусы А и С, саповирус;

     – бактериальные кишечные инфекции: Е. Coli (энтеротоксигенные штаммы), Shigella (геморрагические штаммы), Salmonella typhi, Salmonella species, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis.